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制藥企業環境微生物數據分析及解讀

發布時間：

2019-12-07

近年來，越來越多的法規、文獻，甚至是FDA的警告信中，都不斷提及在無菌檢驗方法驗證、清潔和消毒劑效能驗證、無菌工藝驗證等各種微生物相關的驗證中，除了使用標準菌株以外，也應當使用企業自身環境中分離到的具有代表性的微生物進行相關的驗證實驗。

那么，哪些菌才具有代表性呢？

這就需要企業對環境監測中分離到的微生物進行屬和種水平的鑒定（在超限時對采集到的微生物進行鑒定，以及在未超限時進行周期性的環境微生物鑒定），并且對鑒定結果進行評估，以確定常見的微生物類型，然后根據微生物的種類特征和數量從中篩選，進行相關驗證實驗。

當然，環境微生物數據庫建立的意義不止于此，數據庫的建立有助于企業了解藥品生產過程中微生物的負載情況，對于建立有效的生產過程微生物污染溯源分析體系具有極其重要的現實意義。

環境菌庫的應用

我們（浙江省微生物研究所）對2017-2018年積累的環境微生物數據進行了統計和分析，樣本采樣點絕大部分為相關企業潔凈區或其他受控環境，涵蓋制藥、食品、化妝品等行業，其中以制藥企業為主。基于保密原因，我們并不要求企業提供詳細采樣地點，但通過對歷史數據的分析，我們仍然發現了一些有意思的東西，與大家分享。

細菌真菌檢測比例變化趨勢

2018年全年真菌月度平均檢出率為11.4%，這一數值高于隨機抽取的10家環境微生物數據庫建設情況較好的制藥企業的真菌檢出率（3%-6%）。對此，我們并不意外，相比于細菌多種多樣的鑒定手段，真菌的鑒定手段就顯得匱乏一些。因此，企業在分離到真菌時，更傾向于委托給我們鑒定。
菌群相關性分析我們對兩年來鑒定到種或屬水平的菌種（細菌鑒定率為98.88%，真菌鑒定率為96.89%）進行了聚類分析。眾所周知，環境中的微生物并非獨立存在，各個微生物種屬直接存在著復雜的互作關系。企業在環境監測中采集到的微生物主要體現為兩類關系：一類是Win-Win的互惠關系，一類是Win-lose的抑制關系；具有互惠關系的微生物傾向于共同被檢出，而相互抑制的微生物則可能呈現出相反的變化趨勢。

潔凈環境中檢出的微生物大致可以分為3類：

①與人員攜帶相關：如葡萄球菌屬（Staphylococcus）、微球菌屬（Micrococcus）、短桿菌屬（Brevibacterium）、莫拉氏菌屬（Moraxella）、考克氏菌屬（Kocuria）、皮膚球菌屬（Kytococcus）等，生境主要與人體相關，在這些菌屬的檢出率上也反映出了一定的正相關性；

②與水系統相關：如羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、微桿菌屬（Microbacterium）、污泥單胞菌屬（Pelomonas）等生境主要為水體，常可在水系統中以形成生物膜的積聚，到一定規模時可能造成管道堵塞。

③與土壤相關：如芽孢桿菌屬（Bacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus），這些菌屬都具有較強的抗消殺能力，可能為該潔凈室的土著菌屬，也可能由物料、設備包裝等因素攜帶進入潔凈環境。

從上圖，我們不難看出，不同種屬的微生物之間，以某種方式聯系在一起。例如，可能為同一來源的微生物具有共同檢出的傾向。而定殖菌之間可能存在互惠互利的現象，從而實現在潔凈室環境的持留。
優勢菌種對比

我們對比了2017-2018年檢出率超過1%的菌種，發現兩年優勢菌屬和菌種均十分相似。這表明盡管地域、氣候等因素對菌群結構存在一定的影響，但遵循GMP體系的受控生產環境總體是具有較高的相似性，因此環境中的優勢菌構成也存在著一定的相似性。這也表明，在持續受控的環境中，菌群結構應當是具有穩定性的。研究各個企業、各個時間這種穩定結構的變化可能有助于我們對環境微生物管控水平進行更精確，更數據化的評估。

未知菌屬的分類和溯源無論采用何種的鑒定方法，能否鑒定到種或屬，其實都取決于該方法所依托的背景數據庫的大小。然而無論多大的數據庫均有其局限性，一旦分離到的菌未被背景數據庫收錄，我們就無法獲得其種屬信息。但是，采用基因序列方法進行微生物鑒定的優勢在于，即使我們無法獲得種屬信息，我們依然可以依據其基因序列的相似性進行物種的劃分。因此，我們對未鑒定到種屬的細菌（1.12%）和真菌（3.11%）也從序列水平進行了分類。

從兩年的數據中，我們根據基因序列的相似度，一共得到了細菌97%相似度水平集合113個，99%相似度水平集合218個，真菌97%相似度水平集合45個，99%相似度水平集合50個。這個數量顯然是小于我們實際的未知菌檢出數量的，這意味著，有一些未知菌是多次被檢出的（上圖中色塊大小代表97%相似度水平集合的檢出頻次）。這意味著，即便污染菌的鑒定結果是未知菌屬，我們也可以通過序列相似度的比較，進行基因水平的溯源分析。同時，如果對一些常見未知菌的特性進行進一步研究，可能有助于我們更好的管控生產環境的微生物風險。

特定菌屬的回顧分析除了數據統計以外，我們也可以利用歷史數據運用統計學手段進行一些菌群動態趨勢的預測。如下圖

2017-2018年芽孢桿菌屬（Bacillus）的總體平均檢出率在13.8%左右，總體月度波動較小。對比單個企業的抽樣數據，我們發現無菌藥品生產企業的芽孢檢出率普遍低于10%，一般在6%~8%之間，非無菌制劑和中藥企業的檢出率則根據管控情況不同存在較大波動，一般在15%~30%之間，不排除芽孢桿菌檢出率較高的企業存在選擇性送樣的情況。另外，我們可以依據趨勢推測，在未來1-2個月的芽孢桿菌總體檢出情況應當會保持在13-14%%左右，若實際數據與此出現較大偏離時，可能意味著有不受控情況出現。

后記

制藥生產環境中發現的大多數微生物是人源的革蘭氏陽性桿菌和革蘭氏陽性球菌，真菌則是酵母和絲狀真菌，我們的數據也體現了這一點。同時，我們也在來源于水環境的菌中，發現了一些革蘭氏陰性桿菌，它們通常具有條件致病性，如粘質沙雷菌（Serratia marcescens，又稱褪色沙雷氏菌）。如果企業的水系統中有這些菌的存在，會帶來極高的終產品污染風險。

我們通過數據庫調取了2017-2018年腸桿菌屬、粘質沙雷菌的檢出數據，發現月平均檢出率分別為0.6%、0.1%，這個表明目前國內企業，對這些菌的管控非常到位。產品中污染的微生物來自于原料，環境和人員的相互作用。因此，從原材料、環境、人員和產品中分離檢測并準確鑒定其中的微生物，分析微生物的特性，和變化趨勢，是實現微生物風險評估和管控的基礎。通過建立環境微生物數據庫，確定對應企業自身產品的“不可接受微生物”列表，才能更有效地驗證生產工藝或者消殺是否能夠有效控制原料或者環境來源的“不可接受微生物”，避免其最終污染產品。

后記

經過連續幾年的制藥環境微生物數據庫建設實踐，我們發現雖然相比于自然環境，潔凈環境的微生物種類更少，優勢菌群占比更高，菌群面臨的生存脅迫更大，但潔凈環境的微生態仍具有其獨特的多樣性和穩定性。雖然存在地域差異、產品差異等因素，但各企業潔凈環境中的優勢菌群仍具有一定的相似性，且在一定程度上遵循“二八原則”，既20%的優勢菌屬占總檢出率的80%。
這使得我們利用已知環境微生物數據來評價環境微生物數據庫建設情況，通過優勢菌群的變化來指導微生物管控計劃，通過數據庫來比較不同企業間的微生物管控水平成為可能。

信息來源：微生物所編輯部微生物研究所公眾號