OD600 和麥?zhǔn)蠞岫戎嗌伲?
發(fā)布時(shí)間：
2025-04-30
在微生物實(shí)驗(yàn)中，準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌濃度至關(guān)重要，無論是誘導(dǎo)蛋白表達(dá)時(shí)確定最佳時(shí)機(jī)、做藥敏試驗(yàn)時(shí)標(biāo)準(zhǔn)化接種量，還是培養(yǎng)基驗(yàn)收時(shí)接種定量菌液，都依賴于精準(zhǔn)的細(xì)菌濃度數(shù)據(jù)。目前，OD 值測(cè)定與麥?zhǔn)蠞岫龋?/span>McFarland）法均能實(shí)現(xiàn)細(xì)菌濃度的定量分析，那么這兩種方法具體有哪些差異？實(shí)驗(yàn)室又該如何根據(jù)需求選擇合適的測(cè)定方法呢？
一、OD值
1. OD值不是“濃度”，但它和濃度有關(guān)！
很多人會(huì)以為OD值就是濃度，其實(shí)不完全對(duì)。OD值實(shí)際是“光密度”的縮寫（optical density，OD），用來衡量溶液對(duì)光的吸收程度。當(dāng) 600nm 的光穿過菌液，細(xì)菌越多，光被散射和吸收得越多，OD600 值就越高。
雖然OD值和菌液濃度有關(guān)系，但不是一一對(duì)應(yīng)的，尤其在高OD值時(shí)，這種關(guān)系會(huì)變得不線性，因?yàn)?/span>OD值反映的是總細(xì)胞密度，包括活菌、死菌和細(xì)胞碎片，若培養(yǎng)過程中出現(xiàn)細(xì)胞死亡（如污染、培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)），OD600 值可能虛高，誤導(dǎo)實(shí)驗(yàn)判斷（如誤判為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）。
?? 注意：OD 值≠活菌數(shù)！它反映總細(xì)胞密度（包括死菌和碎片），需結(jié)合平板計(jì)數(shù)校準(zhǔn)。而且OD600 測(cè)前先混勻！細(xì)菌抱團(tuán)或沉淀會(huì)讓結(jié)果不準(zhǔn)，建議用槍吹打 10 次再測(cè)。
2. 為什么選 OD600？
? 干擾少：600nm 是可見光，不是紫外光，不會(huì)被 LB、TSB 等培養(yǎng)基的淺黃色吸收，也不會(huì)損傷細(xì)菌。
? 線性好：波長(zhǎng)越短（例如500nm），光散射越強(qiáng)，靈敏度越高，但線性范圍變窄；波長(zhǎng)越長(zhǎng)（如800nm）則相反。600nm是兼顧靈敏度和寬線性范圍的折中選擇，懸浮細(xì)胞越多，散射越強(qiáng)，OD值越高。
? 歷史慣性：早期分光光度計(jì)常用鎢燈作為光源，其在400-700nm范圍內(nèi)光強(qiáng)穩(wěn)定，600nm成為默認(rèn)選項(xiàng)并沿用至今。
? 標(biāo)準(zhǔn)化：OD600是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中廣泛采用的標(biāo)準(zhǔn)方法，分子克隆、發(fā)酵工程都離不開它。制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，OD600=0.6~0.8 是最佳時(shí)機(jī)。
? 特殊情況需要其他波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量：例如酵母或大型細(xì)胞，推薦使用更高的波長(zhǎng)（如波長(zhǎng)660nm），可以有效減少多次散射干擾。
3. 分光光度計(jì) vs 酶標(biāo)儀，怎么選？
分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀都是利用朗伯-比耳定律，測(cè)定樣本的吸光度。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況進(jìn)行選擇
4、分光光度計(jì)明明只有吸光度A（Absorbance）的功能，為何卻可以將吸光度A當(dāng)作OD值呢？
OD值是入射光與透射光比值的對(duì)數(shù)，或者說是光線透過率倒數(shù)的對(duì)數(shù)。定義式為：
L ——光穿過樣品的距離，即樣品的厚度（可以認(rèn)為是比色皿的寬），單位厘米（cm）;
Aλ ——波長(zhǎng)為λ處的吸光度（Absorbance）由分光光度計(jì)直接測(cè)出
T ——每單位的透射率（transmittance）
I0 ——入射光的強(qiáng)度
I ——透射光束的強(qiáng)度
在這里，我們可以看到，光密度的定義式中，分母l實(shí)際上是一個(gè)光經(jīng)過的距離。在實(shí)際操作中，我們會(huì)使用使用寬度為1 cm的比色皿來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。進(jìn)而，這個(gè)距離便被人為的設(shè)置為了1。因此，便出現(xiàn)了“分光光度計(jì)測(cè)定OD值”這樣的表述。
4. 不同儀器同一樣本測(cè)值不同？
有的同學(xué)發(fā)現(xiàn)，同一菌液在不同儀器上測(cè)的 OD 值會(huì)不一樣，這是因?yàn)閮x器的光學(xué)配置不同，正向光學(xué)系統(tǒng)使用單色光測(cè)量吸光度，而反向光學(xué)系統(tǒng)則利用多色輻射，光穿過樣品后，多色輻射會(huì)被分離為單個(gè)波長(zhǎng)。正向光學(xué)系統(tǒng)的某些組件會(huì)導(dǎo)致測(cè)量 OD 值的差異：比如樣品與檢測(cè)器之間的距離、所用收集透鏡的尺寸和焦距、檢測(cè)器的面積和靈敏度等都會(huì)影響結(jié)果。
?? 解決辦法：固定儀器型號(hào)，每次用培養(yǎng)基空白調(diào)零，新菌株必做 “OD600 - 活菌數(shù)” 標(biāo)準(zhǔn)曲線（梯度稀釋涂平板，擬合公式：細(xì)胞數(shù) = K×OD600）
二、麥?zhǔn)蠞岫龋何⑸锝绲?/strong> “標(biāo)準(zhǔn)化手冊(cè)”
1. 麥?zhǔn)蠞岫裙芾锸鞘裁矗?/strong>
在沒有光度計(jì)的情況下，估算微生物樣品濁度的方法是使用麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)（McFarland turbidity standards）。實(shí)驗(yàn)室里常見的麥?zhǔn)蠞岫裙埽锩媸蔷郾揭蚁┪⒘乙夯蛄蛩徜^懸液，按濁度分成 0.5、1、2 號(hào)等，最常用的 0.5 號(hào)，對(duì)應(yīng)的細(xì)菌濃度大約是 1.5×10? CFU/mL（以大腸桿菌為例）。
用法：目視比濁法。將菌液與麥?zhǔn)瞎懿⒘杏诎咨尘埃高^液體觀察下方黑色線條，當(dāng)模糊程度一致時(shí)，菌液濁度即匹配。
2. 麥?zhǔn)厦芏扔?jì)
作為制備細(xì)菌和真菌細(xì)胞懸液麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)的替代方法，麥?zhǔn)厦芏扔?jì)是一種實(shí)用的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。麥?zhǔn)厦芏扔?jì)經(jīng)校準(zhǔn)后，可測(cè)量 0.3–6.0 麥?zhǔn)蠁挝环秶鷥?nèi)的濁度。
原理：與分光光度計(jì)一樣，麥?zhǔn)厦芏扔?jì)也基于光度法原理。將聚苯乙烯微粒懸浮于特定緩沖液中，使用光徑 1 cm 的分光光度計(jì)在 600 nm 或 625 nm 波長(zhǎng)下（具體波長(zhǎng)取決于所用標(biāo)準(zhǔn)品）調(diào)整至可接受的吸光度范圍。將細(xì)菌懸液濁度調(diào)整至與麥?zhǔn)系刃岫葮?biāo)準(zhǔn)品一致，可使細(xì)菌計(jì)數(shù)處于預(yù)期范圍內(nèi)。光密度以數(shù)字形式直接顯示為麥?zhǔn)蠁挝唬?/strong>McFarland）。
麥?zhǔn)厦芏扔?jì)的組成部件：光源、數(shù)字顯示屏、試管支架、電源開關(guān)和外部電源電纜。
3. 為什么藥敏試驗(yàn)必須用麥?zhǔn)蠞岫龋繃?guó)際標(biāo)準(zhǔn)說了算！
? CLSI（臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)）規(guī)定：抗生素藥敏試驗(yàn)菌液須調(diào)整至 0.5 號(hào)麥?zhǔn)蠞岫龋ㄕ`差 ±20%），否則藥敏結(jié)果可能不準(zhǔn)，影響耐藥性判斷。
? 其他場(chǎng)景：發(fā)酵罐接種前快速粗調(diào)濃度，培養(yǎng)基性能驗(yàn)證、細(xì)菌生化鑒定等需要統(tǒng)一濃度減少人為誤差。基層實(shí)驗(yàn)室沒有分光光度計(jì)也能操作。
4. 麥?zhǔn)蠞岫鹊奈宕?“軟肋”
① 顏色干擾：深黃 / 橙色或棕色培養(yǎng)基（如含色素的肉湯）會(huì)掩蓋濁度，需先做預(yù)試驗(yàn)；
② 菌株差異：革蘭氏陽性菌（如葡萄球菌）細(xì)胞更大，相同麥?zhǔn)咸?hào)對(duì)應(yīng)的 OD600 值比大腸桿菌高 10%-20%，需單獨(dú)校準(zhǔn)；
③ 老化菌液：培養(yǎng)超 24 小時(shí)的菌液可能因自溶導(dǎo)致濁度虛高，實(shí)際活菌數(shù)不足；
④ 儀器依賴：用濁度計(jì)測(cè)麥?zhǔn)蠁挝粫r(shí)，需確保試管直徑與標(biāo)準(zhǔn)管一致；
⑤ 存儲(chǔ)條件：標(biāo)準(zhǔn)管要避光保存！光照會(huì)導(dǎo)致硫酸鋇沉淀，使用前需檢查是否有分層。
三、核心區(qū)別對(duì)比：一張表教你選對(duì)方法
四、總結(jié)：按需選擇，靈活運(yùn)用！
? 追求精準(zhǔn)選 OD600：適合需要?jiǎng)討B(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)，比如畫生長(zhǎng)曲線、優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)間，關(guān)鍵是做好菌株校準(zhǔn)。
? 需要標(biāo)準(zhǔn)化選麥?zhǔn)蠞岫龋?/strong>藥敏試驗(yàn)、微生物檢測(cè)必用，操作簡(jiǎn)單快速，記得避開顏色和菌株差異的坑。
? 兩者互補(bǔ)：先用麥?zhǔn)瞎艽终{(diào)濃度，再用 OD600 精準(zhǔn)驗(yàn)證，雙重保險(xiǎn)更安心！
掌握這兩種方法，細(xì)菌濃度測(cè)定從此得心應(yīng)手！記得轉(zhuǎn)發(fā)給實(shí)驗(yàn)室小伙伴，一起告別細(xì)菌濃度測(cè)定的煩惱～
互動(dòng)思考：如果你的實(shí)驗(yàn)需要同時(shí)測(cè) 100 個(gè)菌液濃度，且要求精度＜5%，你會(huì)怎么設(shè)計(jì)方案？評(píng)論區(qū)分享你的思路吧！
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